Оглавление
Введение
В мире появляется все больше тестов, способных определить наличие в организме коронавируса SARS-CoV-2. В середине ноября 2020 года, было представлено более 400 различных тестов, которые можно разделить на три вида:
1. ПЦР-тест.
2. Тест на антиген.
3. Тест на антитела.
Прохождение первого и второго теста, позволяют с высокой вероятностью обнаружить коронавирус в организме человека на момент тестирования и указать на то, что протестированный человек может быть или не быть потенциальным источником заражения. Третий тест позволяет определить, был ли человек инфицирован коронавирусом ранее. Рассмотрим каждый из трёх видов тестирования.
Методы тестирования на коронавирус
Ниже рассмотрим ПЦР-тест, анализ на вирусные антигены и анализ на антитела.
ПЦР-тест
ПЦР (Полимеразная Цепная Реакция ) тест, который так же называется Молекулярная диагностика, позволяет обнаружить вирус COVID-19.
Полимераза – это фермент (органическое вещество, вырабатываемое живой клеткой и регулирующее обмен веществ в организме), главной биологической функцией которого является синтез полимеров нуклеиновых кислот
ПЦР– диагностика используется для установления факта заболевания коронавирусом. Вирус можно обнаружить сразу после заражения, даже если у пациента еще нет проявлений болезни.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR- polymerase chain reaction), изобрёл в 1983 году, американский биохимик Кэри Мюллис, получивший за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время, ПЦР-диагностика является одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний и
считается наиболее точным лабораторным методом обнаружения, отслеживания и изучения коронавируса. Метод основан на полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени. Более полное название: ОТ-ПЦР, то есть Полимеразная Цепная Реакция с Обратной Транскрипцией.
ПЦР – это метод выявления присутствия определенного генетического материала, в том числе вируса. Для обнаружения искомого генетического материала, используются специальные маркеры – флуоресцентные красители. С помощью этого метода, можно увидеть результаты практически сразу, еще в процессе исследования, либо только после завершения теста.
Вирус, генетический материал и обратная транскрипция.
Вирус – это микроскопическая совокупность генетического материала, окруженного молекулярной оболочкой. Генетический материал может быть представлен либо ДНК, либо РНК.
ДНК (Дезоксирибонуклеиновая кислота) – это состоящая из двух цепей молекула, которая встречается во всех организмах, таких как: животные, растения и вирусы, и содержит генетический код или алгоритм того, как эти организмы строятся и развиваются.
РНК (Рибонуклеиновая кислота) – это состоящая из одной цепи молекула, которая копирует, транскрибирует и передает части генетического кода белкам, чтобы они могли синтезировать и выполнять функции, которые поддерживают жизнь и развитие организмов. Существуют различные типы РНК, которые выполняют копирование, транскрибирование и передачу.
Коронавирус (SARS-CoV-2), содержат только РНК, что означает, что этот вирус предназначен для проникновения в здоровые клетки для размножения и выживания. Оказавшись внутри клетки, вирус SARS-CoV-2 использует свой собственный генетический код (РНК) чтобы взять под контроль и “перепрограммировать” клетки так, чтобы они стали фабриками по производству вирусов SARS-CoV-2.
Обратная транскрипция и амплифицирование (копирование)
Для того, чтобы при помощи ПЦР выявить на раннем этапе присутствие в организме коронавируса, необходимо преобразовать РНК в ДНК. Этот процесс преобразования РНК в ДНК, называется “обратной транскрипцией“. Обратная транскрипция РНК в ДНК делается потому, что только ДНК можно копировать (или амплифицировать), что и является ключевой частью процесса ПЦР. Модификация ПЦР, в которой используется обратная транскрипция получил название ОТ-ПЦР.
Амплифицирование (копирование) предоставляет для анализа большое количество участков вирусной ДНК, чтобы точно подтвердить, присутствует вирус или нет. Без амплицирования, пришлось бы искать ничтожное количество вируса среди миллионов цепей генетической информации. Амплифицируется определенная часть транскрибируемой вирусной ДНК в сотни тысяч раз.
Как всё происходит на практике
Перечислим основные шаги ПЦР тестирования.
1. Отбор пробы.
Из тех частей тела, где скапливается коронавирус, например из носа или горла человека, берется образец для проведения исследования. Образец обрабатывают несколькими химическими растворами, которые удаляют вещества, такие как белки и жиры, и извлекают только присутствующую в нем РНК. Эта извлеченная РНК представляет собой смесь собственного генетического материала человека и РНК коронавируса, если она присутствует в образце.
2. Обратная транскрипция.
C помощью определенного фермента в реакции обратной транскрипции, РНК превращают в ДНК. Затем добавляются дополнительные короткие фрагменты ДНК, которые комплементарны (соответственны) определенным частям транскрибированной вирусной ДНК. Эти фрагменты прикрепляются к заданным участкам вирусной ДНК, если вирус присутствует в образце. Некоторые из добавленных генетических фрагментов предназначены для построения цепей ДНК во время амплификации, в то время как другие предназначены для построения ДНК и добавления к цепям маркерных меток, которые затем используются для выявления вируса.
3. Амплифицирование (копирование).
Смесь помещается в прибор (Амплификатор), в котором смесь нагревается и охлаждается для того, чтобы запустить определенные химические реакции, создающие новые, точные копии заданных участков вирусной ДНК. Цикл многократно повторяется, чтобы продолжить копирование заданных участков вирусной ДНК. После каждого цикла происходит удвоение количества, по сравнению с предыдущим. Обычно 35 циклов, что означает, что к концу процесса из каждой цепи вируса, присутствующей в образце, создается около 35 миллиардов новых копий участков вирусной ДНК.
4. Замеры и вывод показателей.
По мере того, как создаются новые копии вирусных участков ДНК, маркерные метки прикрепляются к цепям ДНК, а затем высвобождают флуоресцентный краситель, уровень которого измеряется вычислительным устройством прибора, с выводом показателя в режиме реального времени, на экран. Вычислительное устройство отслеживает уровень флуоресцентного сигнала в образце, после каждого цикла. Превышение этим показателем определенного уровня флуоресценции, является подтверждением присутствия вируса.
Отслеживается количество циклов удвоения, которое требуется для достижения порогового уровня для того, чтобы оценить тяжесть инфекции: чем меньше циклов, тем тяжелее вирусная инфекция.
Весь процесс может быть выполнен в одной закрытой пробирке.
Подведём итог
Суть метода ПЦР заключается в том, что генетическая информация вируса, сосредоточенная в молекулах РНК, многократно копируется в лабораторных условиях специальным прибором – амплификатором, увеличивая свою концентрацию в два раза в каждом цикле копирования. Это дает возможность выявить вирус или бактерию даже в тех случаях, когда его количество составляет лишь сотню клеток в миллилитре крови. Если же генетическая информация тестируемой коронавируса в пробе отсутствует, то она не копируется и не определяется.
Для проведения ПЦР в цифровом амплификаторе, пробу, при помощи специального прибора, случайным образом разделяют на большое количество изолированных микрокомпартментов, так называемых микрореакторов. В каждый микрореактор попадают специфичные к ДНК-мишени праймеры и зонды (флуоресцентный краситель), а также, целевые или фоновые фрагменты ДНК. Далее, проводится термоциклирование образца и полимеразно-цепная реакция проходит только в тех ячейках, куда попала ДНК-мишень. Это приводит к возникновению в них флуоресцентного сигнала, который регистрируется при помощи специализированной системы – ридера.
Поскольку вирусы присутствуют в теле только в течение определенного временного отрезка, ПЦР тест нельзя использовать для выявления инфекций, появлявшихся в прошлом. Для выявления, отслеживания и изучения инфекций, появлявшихся в прошлом, особенно тех, которые могли развиваться и распространяться без симптомов, необходимо использовать другие методы.
Анализ методом ПЦР обычно проводится тем, у кого есть симптомы респираторного заболевания или тем, кто имел контакты с возможным источником инфекции. Отсутствие генетического материала возбудителя (отрицательный результат) означает, что человек не инфицирован на момент взятия анализа. Для подтверждения или исключения наличия инфекции, тест выполняется повторно через определенные промежутки времени. Однако, молекулярные РНК-тесты не являются абсолютно надежными и могут у инфицированных пациентов дать отрицательный результат. Это зависит от:
– достаточности содержания вируса в материале, выбранном для ПЦР теста на той или иной стадии инфекции;
– качества отобранного материала;
– предела чувствительности самого ПЦР теста.
Анализ на вирусные антигены.
Тест на антиген является одним из тестов, применяемых при диагностике коронавируса.
Антиген (antigen от antibody generator – производитель антител) – любое вещество, которое организм рассматривает как чужеродное или потенциально опасное и против которого организм обычно начинает вырабатывать собственные антитела (иммунный ответ). Обычно, в качестве антигенов выступают белки, однако простые вещества, даже металлы, также могут становиться антигенами, в сочетании с собственными белками организма и их модификациями.
Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) одобрила антигенные тесты для диагностики ОРВИ-CoV-2.
ОРВИ (Острая Респираторная Вирусная Инфекция) – заболевание дыхательных путей, причиной которого является попадание в организм вирусной инфекции. Среди возбудителей, наиболее частыми являются – вирусы гриппа, парагриппа, аденовирусы и риновирусы.
На данный момент, рекомендуется подтвердить отрицательные результаты с помощью генетического теста (ПЦР- теста). Этот тест показывает, есть ли в организме белки, входящие в состав вируса и распознаваемые иммунной системой. Если антигенов нет, то человек не заразился. Для этого теста, врач также берет мазок из носа и ротоглотки. Проведение теста на антиген ограничивается начальной стадией заболевания – до 5-7 дней после появления симптомов, свидетельствующих о COVID-19, поскольку именно тогда, вирус интенсивно реплицируется (то есть размножается). На поздних стадиях COVID-19, концентрация вируса может снижаться, и тесты могут не обнаружить его присутствия.
Анализ на антитела
Разберём, что же такое антитела и против чего они борются.
Антитела
Антитела – это молекулы, вырабатываемые иммунной системой, с помощью которых организм человека борется с вторжением возбудителей инфекций, аллергенами и многим другим. Эти молекулы – антитела называются иммуноглобулинами (Ig). Иммуноглобулины разделяются на пять классов и обозначаются латинскими буквами А, М, G, Е, D, то есть IgA, IgM, IgG, IgE, IgD, соответственно.
Наиболее активную роль при заболевании коронавирусом играют IgM, IgG и IgA.
Иммуноглобулины и коронавирус
На первой неделе заболевания коронавирусом, начинают синтезироваться антитела – иммуноглобулин М (IgM). Эти антитела первыми встречаются с инфекцией, поэтому считаются маркерами острой первичной инфекции. Однако, тест на определение антител класса М, может давать неспецифическую реакцию. Это обусловлено тем, что на антитела класса М возложена ответственность первыми начать отражать инфекцию и сделать это максимально быстро и даже “поспешно”, поэтому эти белки не очень специфичны (“успешны”) и могут не очень точно улавливать вирус. К неспецифической реакции с тест – системой, могут привести и острые, хронические воспалительные процессы, и аутоиммунные заболевания, и проблемы с щитовидной железой, и беременность. Подобная реакция получила название – “ложноположительный” результат.
При стандартной коронавирусной инфекции, антитела IgM, как правило, через месяц исчезают и заменяются на более специфичные антитела IgG. Но последние научные данные свидетельствуют о том, что при коронавирусном заболевании, антитела IgM могут сохраняться более длительное время – до 1,5-3 месяцев от появления симптомов, когда уже сам вирус давно не обнаруживается.
Помимо антител IgM и lgG, вырабатываются и антитела IgA. Кратко охарактеризуем эти антитела.
Иммуноглобулины класса М (IgМ), первыми вырабатываются при первичный контакте организма с антигеном и являются показателями острого инфекционного процесса.
Иммуноглобулины класса А (IgA) вырабатываются в острый период инфекции. Их основная цель – защитить слизистые оболочки от коронавируса. IgA более избирательны (специфичны), вырабатываются строго на коронавирус. Их уровень снижается после выздоровления, примерно через 1,5- 2 месяцам после инфицирования.
Иммуноглобулины класса G (IgG), синтезируются последними, через 5-6 недель с момента попадания вируса в организм, и сохраняют информацию о коронавирусе. Обычно IgG являются архивом памяти перенесенных инфекций, в большинстве случаев пожизненно, либо на несколько лет. Механизмы развития иммунной реакции на коронавирус пока изучаются. Неясно, стойкий иммунитет формируется или нет. Это предстоит узнать. Но в любом случае, выявление антител IgG, свидетельствует о факте попадания коронавируса в организм и иммунном ответе организма.
Скрининг – тест на антитела
Для определения наличия антител IgM/IgG к вирусу SARS-CoV-2 существует комплексный скрининг – тест.
Скрининг-Тест (Screening Test) – это простой и быстрый диагностический тест. Другое название: экспресс-тест.
Скрининг – тест на коронавирус COVID-19, можно проводить на суммарные антитела IgA+IgM+IgG. То есть, тест включает в себя диагностику трёх классов иммуноглобулинов:
– иммуноглобулин IgA, который вырабатываются в слизистых оболочках, при проникновении через них вируса, через 3-4 дня.
– иммуноглобулин IgM, который свидетельствует о продолжающемся остром заболевании, то есть, о текущей инфекции. Антитела этого типа появляются через 5-7 дней с момента инфицирования;
– иммуноглобулин IgG, который свидетельствует о давнем заражении или о давно перенесенном заболевании. Антитела этого типа вырабатываются через 15-20 дней, и являются иммунным ответом организма.
Результаты теста готовы через один рабочий день.
Скрининг – тест нужно проходить людям впервые или, если тест, проходимый ранее, дал отрицательный результат. Результат скрининг – теста выдается одной строкой: “положительно” или “отрицательно”. Целесообразно провести исследование мазка из зева методом ПЦР. Если результат ПЦР отрицательный или нет признаков болезни, повторить тест на антитела через 2-3 недели.
При положительном результате скрининг – теста, может потребоваться детализация, то есть развёрнутый анализ на отдельные антитела IgM и IgG для уточнения стадии заболевания. Ниже приведём пример двух отрицательных тестов на антитела:
Развёрнутый анализ на отдельные антитела IgM и IgG
Анализ на отдельные антитела IgM и IgG, необходимо проводить для уточнения стадии заболевания.
Тест определяет иммуноглобулины классов М и G, а результаты выдаются по каждому антителу. Развёрнутый анализ выполняется Иммунохроматографическим методом. Ответ выдаётся в формате “обнаружено/не обнаружено”.
Иммунохроматографический анализ (ИХА,) основан на принципе тонкослойной хроматографии и включает реакцию между антигеном и соответствующем ему антителом в биологических материалах. Проводится с помощью специальных тест-полосок, панелей или тест-кассет.
Иммунохроматограф быстро связывает антитела с антигеном и разделяет компоненты смеси с использованием капиллярных сил. В качестве материала для исследования, используется капиллярная кровь (из пальца), венозная кровь с антикоагулянтом, плазма или сыворотка. Результат готов в течение 8-10 мин, после внесения разбавленного биоматериала в кассету с реагентами и представляется визуально в виде окрашенных полосок: тестовой и контрольной.
Доступно два вида наборов:
– для определения иммуноглобулина IgG;
– для определения иммуноглобулина IgM.
Для уменьшения вероятности получения ложноотрицательного результата, рекомендуется использовать оба набора. Ниже приводим иллюстрацию иммунохроматографической тест-системы.
Символом G обозначен индикатор иммуноглобулина IgG, символом M – индикатор иммуноглобулина IgM, а символом C – маркер успешности проведения экспресс-теста. Отсутствие окраски маркера C, указывает на недействительный результат.
Пример 1. Маркер G и M не окрашены. Результат “Отрицательный”. Следует иметь в виду, что отрицательный результат не дает абсолютной гарантии отсутствия инфекции.
Пример 2. Маркеры G окрашен, а маркер M не окрашен. Тест на антитела IgG “Положительный”, то есть организм сформировал иммуноглобулины более устойчивые к вирусу, отвечающие за постоянный иммунитет человека к данному вирусу.
Пример 3. Маркеры G не окрашен, а маркер M окрашен. Тест на антитела IgM “Положительный”, то есть вирус может присутствовать в организме человека на ранней стадии и началась первичная реакция организма на инфекцию. Иммуноглобулины типа M (IgM), отвечают за первичную реакцию защитной системы организма человека. Антитела IgM обычно появляются на 3-7 день после появления симптомов.
Пример 4. Маркеры G и M окрашены. Тест на антитела IgM и IgG одновременно “Положительный”, а это означает, что вирус может присутствовать в организме человека на вторичной стадии, и организм выделяет первичные иммуноглобулины, но началось продуцирование иммуноглобулинов более устойчивых к вирусу, также отвечающих за постоянный (долгосрочный) иммунитет человека к данному вирусу.
Возможность повторного заражения и его причины.
Как было отмечено выше, антитела (IgM, IgG и IgА), появившиеся в организме человека в результате заболевания коронавирусом или в результате вакцинации не вечны.
В первые дни заражения коронавирусом, в организме человека вырабатываются антитела IgM. После преодоления острой фазы ковида, количество антител IgM начинает снижаться, вплоть до полного их исчезновения после выздоровления.
Антитела IgG, появляются в организме человека в пик болезни и остаются в организме на длительный период после выздоровления. Присутствие антител IgG, должно защищать организм человека от повторного заблевания ковидом.
Но, как показывает жизнь – повторное заражение коронавирусом, возможно даже при высоком содержании антител в крови. Причин для этого немало. Перечислим лишь некоторые из них:
– организм человека ослаблен, например, из-за тяжелых хронических заболеваний;
– антитела, которые защищают от новых заражений, составляют лишь небольшую долю в общем уровне антител, а современные методы тестирования определяют именно общий показатель;
– вакцинация не может исключить риск повторного заболевания, так как эффективность прививки рассчитана на три-шесть месяцев, после чего степень защиты может снизиться до 60-70% от первоначальной.
– серьезные нарушения иммунной системы человека, например принимающие иммуносупрессоры (лекарства, угнетающие иммунитет);
– не известен точный уровень антител, необходимый для блокирования повторного заражения;
– антитела после первого заражения COVID-19, исчезают примерно через 6-8 месяцев, после чего повторное инфицирование возможно вновь, а рассчитывать на повышение результативности препарата можно только через год-два;
– если при первом заражении инфекцией иммунитет был очень слабо выражен, а это может быть и при бессимптомной форме, то тогда человек может заболеть повторно;
– одновременное заражения сразу двумя штаммами вируса, то есть, второй штамм остался незамеченным. Организм полностью поборол первый штамм. Иммунитет вырабатывается к одному штамму, а изменившийся вирус начинает действовать уже по-другому, воздействовать на другие точки, и человек снова окажется заражен.
Повторное заболевание COVID-19 происходит гораздо реже, чем первичное. Заболевшие во второй раз могут переносить инфекцию тяжелее, чем в первый. Одна из причин тяжелых симптомов при втором заражении – антителозависимое усиление инфекции (Antibody-Dependent-Enhancement, ADE)– механизм, при котором вирусы используют иммунную систему уже зараженного человека, для еще более эффективного и массового поражения организма. Вирус использует антитела “хозяина” в качестве “троянского коня”. Антитела, связываясь с вирусом, не борются с ним, а обеспечивают его более полное поглощение клеткой, способствуя, таким образом, его размножению.
Вакцина нового типа
Американские ученые из Duke Human Vaccine institute, завершают создание вакцины нового типа, которая защищает от всех известный коронавирусов и их штаммов. Новая вакцина создана на основе технологии. Это не генетическая вакцина, как РНК-вакцины, уже используемые при вакцинации. В основе лежит технология с применением наночастиц, атакующих определенный рецептор шиповидного белка коронавируса, связывающего вирус с человеческой клеткой. Новая вакцина запускает нейтрализующие антитела через наночастицы. Наночастица состоит из части коронавируса, которая позволяет ей связываться с рецепторами клеток организма, и содержит химический усилитель, называемый адъювантом. В результате, белки коронавируса становятся уязвимыми для перекрестно-атакующих их антител, вырабатываемых иммунной системой человека. Первые тесты, проведенные на приматах показали, что вакцина эффективно подавляет коронавирус. Вакцина нового типа готова к испытаниям на людях.
Заключение
Пока новой вакцины нет , необходимо знать о последствиях, после выздоровления от коронавируса. Вирус поражает эндотелий внутренних оболочек сосудов, результате чего:
– страдает главная мышца сердца – миокард. Через некоторое время появляется слабость без особых причин, перебои в работе сердца, усиливается одышка, заметно отекают ноги.
– нарушается работа почек. С утра опухают глаза, руки. Человек пьет как обычно, а в туалет бегает часто, моча мутная, слишком желтая.
– нарушается работа центральной нервной системы. Возникает бессонница, тревожность, депрессия
Реабилитация под наблюдением врача может продлиться от 3 до 12 месяцев. Процесс реабилитации ускорит спокойный отдых (гуляние на природе). Для полноценного сна поможет мелатонин, который не является снотворным препаратом и который нужно принять за 30-40 минут до сна. Во время болезни, запасы белков быстро расходуются, а они помогают восстановиться поврежденным тканям. В рационе должны присутствовать мясо, рыба, яйца, бобовые, соевые продукты. Соевые продукты содержат триптофан, убирающий проблемы с психикой.
Новой вакцины пока еще нет, но она “на подходе”. ВОЗ рекомендует постоянно пользоваться масками, находиться в вентилируемых помещениях, соблюдать гигиену рук, избегать скопление людей.
Будьте здоровы. Соблюдайте все правила защиты от коронавируса!
